Come contare i nuclei cellulari....senza perdere il conto!

Quando si guarda un'immagine tramite un microscopio a fluorescenza o un microscopio confocale, è assai frequente marcare i nuclei delle cellule. Questa, oltre ad essere una buona pratica per la messa a fuoco dell'immagine, è anche molto utile per confrontare il numero delle cellule presenti nelle diverse condizioni sperimentali.

La conta dei nuclei può essere alquanto noiosa e piena di errori qualora nel campo siano presenti molte cellule e si debba procedere alla conta manuale.

Un programma che ci viene in aiuto è ImageJ, un software dalle molteplici funzioni e scaricabile gratuitamente al seguente link:http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html

Nel caso in cui i nuclei siano colorati con un solo colore, è possibile fare una conta in maniera automatizzata.

Da File -> Open è possibile importare la nostra immagine  e, se essa è colorata (RGB), occorre prima di tutto trasformarla in "greyscale" facendo: "Edit" -> Options -> conversion to scale when converting. E poi scegliendo Image -> Type -> 16-bit.

A questo punto occorre fissare un threshold in modo da eliminare il rumore di fondo dell'immagine: Image -> Adjust -> Threshold seguito da Process ->Subtract background e Apply.

A volte ci sono nuclei che si sovrappongono sembrando un unico nucleo: in questo caso è possibile tracciare una piccola linea di separazione cliccando su Process -> Binary -> Watershed. 

Ora siamo pronti per contare tutti i nuclei presenti nel nostro campo. Scegliamo il menu a tendina Analyze  e clicchiamo su Analyze particles. Compare una nuova finestra con cui possiamo scegliere come impostare la conta. Il programma ci chiede, innanzitutto, di definire quali particelle escludere dalla conta fissando le dimensioni delle particelle in pixel. Se vogliamo contare tutti i nuclei evidenziati, lasciamo la scelta 0-Infinity. 

Con il parametro Circularity si escludono le particelle in base alla loro forma e lasciando il valore di default è possibile contarle tutte. Selezionando il valore 1 si contano solo i nuclei perfettamente circolari, mentre selezionando il valore 0 solo quelli allungati.

Mediante il menu Show possiamo decidere di visualizzare eventuali problemi riscontrati nella conta scegliendo la visualizzazione "outline": infatti, in seguito alla scelta del comando, compare una nuova immagine delle particelle contate corredate di un numero che ci permette di controllare quali di esse sono state escluse. Display results  fa comparire una nuova finestra con i risultati della conta, mentre summarize fa un riassunto di tutte le informazioni relative all'immagine. Add to manager salva la conta dei nuclei in modo tale che l'immagine già analizzata possa essere utilizzata per ulteriori indagini. 

Possiamo, inoltre, considerare alcune altre funzioni: “Exclude on Edges”  che consente di escludere dalla conta le particelle che si trovano a bordo dell'immagine e “Include Holes” che esclude le particelle che disabilita la conta delle particelle incluse dentro altre particelle. 

Pronti a visualizzare il risultato? Basta cliccare so OK! 


E si può anche aggiungere di più...l'altro giorno mi sono ritrovata a preparare una presentazione per un congresso all'ultimo minuto e mi serviva davvero qualcosa di immediato e facilmente interpretabile per dimostrare che nei miei campioni si accumula un numero sempre maggiore di particelle col passare del tempo. Dunque, dopo aver seguito le istruzioni precedenti, ho scelto Analyse -> Plot Profile. Il risultato è stato perfetto per rappresentare intensità e densità dei miei spots: