Una lettura profonda del DNA - il sequenziamento

"At the deepest level, all living things that have ever been looked at have the same DNA code."

La frase di Richard Dawkins sta risuonando nella mia mente mentre cerco di leggere la mia sequenza su un cromatogramma. Infatti, sfortunatamente, sto cercando la squenza di alcune varianti di splicing, cioè qualcosa che rende la mia sequenza più corta dell'originale. quindi, cerco una sequenza non certo con lo stesso codice!
Il mio percorso sperimentale è stato lungo: la lotta con il protocollo di PCR perchè ho lavorato come al solito con un gene sfortunato e con improbabili reagenti e condizioni. Alla fine ho ottenuto bande pulite, ma devo comunque giustificare la presenza di bande addizionali e inaspettate.
Ho cercato un softwarenel mio istituto di ricerca, ma è sotto licenza e gelosamente custodito dal proprietario.
Ho pensato, allora, di chiedere nuoamente aiuto a GENtle.
E così ho importato direttamente la mia sequenza target dall'interfaccia web. Poi ho importato la sequenza derivata dal cromatogramma direttamente dal formato AB1 con file -> import. E così il cromatogramma è stato direttamente importato nella sezione "sequences".
Mentre analizzo il cromatogramma, posso modificarlo con View -> Edit sequences e così ho cambiato alcune basi non correttamente riconosciute. Infatti, il programma fa errori e occorre controllare la sua interpretazione dei dati. Purtroppo, l'editing è disponibile solo in modalità di sovrascrittura....
Inoltre, il programma non cita alcun strumento per analizzare il parametro "signal" (ndr controlla il "signal intensity number" nel cromatogramma per sapere se i picchi non sono interpretabili).
Inoltre, se soffrite di solitudine durante questo lavoro noioso, ho scovato anche "qualcuno" capace di leggere la sequenza in View -> read sequences aloud.

Infine, in Tool -> sequencing assistent ho aperto una finestra per scegliere le sequenze da allineare e ho trovato la giusta collocazione del mio frammento sul filamento completo di cDNA.

Come contare i nuclei cellulari....senza perdere il conto!

Quando si guarda un'immagine tramite un microscopio a fluorescenza o un microscopio confocale, è assai frequente marcare i nuclei delle cellule. Questa, oltre ad essere una buona pratica per la messa a fuoco dell'immagine, è anche molto utile per confrontare il numero delle cellule presenti nelle diverse condizioni sperimentali.

La conta dei nuclei può essere alquanto noiosa e piena di errori qualora nel campo siano presenti molte cellule e si debba procedere alla conta manuale.

Un programma che ci viene in aiuto è ImageJ, un software dalle molteplici funzioni e scaricabile gratuitamente al seguente link:http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html

Nel caso in cui i nuclei siano colorati con un solo colore, è possibile fare una conta in maniera automatizzata.

Da File -> Open è possibile importare la nostra immagine  e, se essa è colorata (RGB), occorre prima di tutto trasformarla in "greyscale" facendo: "Edit" -> Options -> conversion to scale when converting. E poi scegliendo Image -> Type -> 16-bit.

A questo punto occorre fissare un threshold in modo da eliminare il rumore di fondo dell'immagine: Image -> Adjust -> Threshold seguito da Process ->Subtract background e Apply.

A volte ci sono nuclei che si sovrappongono sembrando un unico nucleo: in questo caso è possibile tracciare una piccola linea di separazione cliccando su Process -> Binary -> Watershed. 

Ora siamo pronti per contare tutti i nuclei presenti nel nostro campo. Scegliamo il menu a tendina Analyze  e clicchiamo su Analyze particles. Compare una nuova finestra con cui possiamo scegliere come impostare la conta. Il programma ci chiede, innanzitutto, di definire quali particelle escludere dalla conta fissando le dimensioni delle particelle in pixel. Se vogliamo contare tutti i nuclei evidenziati, lasciamo la scelta 0-Infinity. 

Con il parametro Circularity si escludono le particelle in base alla loro forma e lasciando il valore di default è possibile contarle tutte. Selezionando il valore 1 si contano solo i nuclei perfettamente circolari, mentre selezionando il valore 0 solo quelli allungati.

Mediante il menu Show possiamo decidere di visualizzare eventuali problemi riscontrati nella conta scegliendo la visualizzazione "outline": infatti, in seguito alla scelta del comando, compare una nuova immagine delle particelle contate corredate di un numero che ci permette di controllare quali di esse sono state escluse. Display results  fa comparire una nuova finestra con i risultati della conta, mentre summarize fa un riassunto di tutte le informazioni relative all'immagine. Add to manager salva la conta dei nuclei in modo tale che l'immagine già analizzata possa essere utilizzata per ulteriori indagini. 

Possiamo, inoltre, considerare alcune altre funzioni: “Exclude on Edges”  che consente di escludere dalla conta le particelle che si trovano a bordo dell'immagine e “Include Holes” che esclude le particelle che disabilita la conta delle particelle incluse dentro altre particelle. 

Pronti a visualizzare il risultato? Basta cliccare so OK! 


E si può anche aggiungere di più...l'altro giorno mi sono ritrovata a preparare una presentazione per un congresso all'ultimo minuto e mi serviva davvero qualcosa di immediato e facilmente interpretabile per dimostrare che nei miei campioni si accumula un numero sempre maggiore di particelle col passare del tempo. Dunque, dopo aver seguito le istruzioni precedenti, ho scelto Analyse -> Plot Profile. Il risultato è stato perfetto per rappresentare intensità e densità dei miei spots:


 

Nella giungla degli housekeeping genes

Per svolgere in maniera corretta una Real Time PCR è fondamentale scegliere in maniera opportuna il gene di riferimento, ovvero quello che non varia nella sua espressione tra differenti campioni o condizioni sperimentali. 

Lo studio approfondito delle condizioni sperimentali e di quanto già presente in letteratura è importante per comprendere verso quali geni orientarsi. 

Tuttavia, altrettanto importante è eseguire una Real Time "di prova" per fare un analisi di almeno tre, quattro geni al fine di testare il loro comportamento nelle proprie condizioni sperimentali.

A questo punto, come fare per orientarsi nella giungla dei cicli soglia ottenuti? Quale sarà il gene, che in maniera statisticamente significativa non varia? 

Per saperlo ci viene in aiuto NormFinder, una semplice "MACRO" che si può aggiungere molto facilmente ad Excel: è possibile scaricarla dal sito
http://www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm.

Una volta scaricata la macro, occorre ricordare di inserire nel classico foglio Excel i dati ottenuti dalla Real Time in forma logaritmica (è bene possedere almeno un triplicato per ogni gene). In cambio, nel giro di pochi secondi, ci viene restituito un valore di stabilità per ogni gene testato. Esso è una misura diretta della variazione stimata dell'espressione genica e permette di distinguere quel gene che ha una minor variazione tra i campioni e le condizioni testate.

Come disegnare primers efficienti

Chiunque si occupi di sequenze genomiche o proteiche sa quanto siano preziose le informazioni che si possono ricavare dall'analisi delle sequenze raccolte in banche dati. Infatti, a partire da esse è possibile ottenere dati sulle sequenze conservate tra diverse specie; conoscere domini specifici all'interno delle sequenze; riconoscere i siti per gli enzimi di restrizione e disegnare plasmidi.

Esistono alcuni programmi estremamente completi che consentono di svolgere queste operazioni e che forniscono anche un supporto grafico utile a visualizzare le azioni compiute, ma il più delle volte sono costosi e non si ha la possibilità di acquistarli.

Navigando su web alla ricerca di un buon software per studiare le caratteristiche e la specificità di primers, mi imbatto in un programma free, che mima in tutto VectorNTI e che è installabile su qualsiasi sistema operativo. Si tratta di GENtle (http://gentle.magnusmanske.de/).

Vediamone le potenzialità. In primo luogo, esso ha un'interfaccia Web che consente di scaricare direttamente da NCBI la sequenza per la quale stiamo cercando di disegnare i primers, con tutte le relative informazioni. Sulla destra della pagina compare anche un disegno della mappa della sequenza, che mette in evidenza anche tutti i siti di restrizione.

Una volta cercati i primers su database online, è assolutamente necessario controllarne le caratteristiche al fine di evitare dimeri di primers, hairpins e match aspecifici che possono seriamente apportare errori alla successiva analisi delle sequenze target.

A tal fine, basta cliccare col tasto destro sulla sequenza e sezionare la voce PCR nel menù a tendina perchè si apra uno strumento per l'analisi dei primers che abbiamo scelto. 

3. Da File -> Enter sequence è possibile inserire la sequenza di tutte le coppie di primers che ci interessa analizzare.

4. Sotto la voce PCR/primers (nel menu a sinistra) ricompare il tools di analisi dei primers che comprende informazioni come: entropia e entalpia della sequenza, lunghezza, percentuale in GC, posizione e uno score che valuta il self annealing.

Come fare per sapere se tutti i parametri indicati sono corretti? Basta andare nel menu a tendina di Edit e scegliere  Troubleshoot e subito ci viene elencato cio' che è sbagliato e incompatibile nella nostra sequenza.

Cio' che è veramente interessante è che se le caratteristiche non ci soddisfano possiamo scegliere un'altra sequenza direttamente dal tasto  Edit.

Io ho disegnato alcuni primers che funzionano davvero a meraviglia! Spero sia lo stesso per voi!!